İçerik
- aşamaları
- Yöntem 1 Gram boyama ile bir bakteri tanımlayın
- Yöntem 2 Ziehl-Neelsen Boyama Testi gerçekleştirin
- Yöntem 3 Bakterilerin davranış ve görünüşünü incelemek
- Yöntem 4 Tüm sonuçları yorumla
Bakterilerin tanımlanması karmaşık bir iştir. Sebeplerden biri, tahminlere göre dünyada 10 000 ila 1 milyar bakteri türü var! Bakterilerin doğru bir şekilde tanımlanması, özellikle bir hastalığın doğru tedavisinin büyük oranda soruna neden olan mikrop türüne bağlı olduğu tıbbi alanda çok önemlidir. Çoğu durumda, tanımlama eleme temelinde yapılır. Bir bakteri tanımlamak için, boyama testleri yapmanız, görünümünü analiz etmeniz ve farklı koşullara nasıl iyi tepki verdiğini gözlemlemeniz gerekir. Hızlı bir sonuca ihtiyacınız varsa, laboratuara göndermek için bir DNA örneği alın.
aşamaları
Yöntem 1 Gram boyama ile bir bakteri tanımlayın
- belirlemek Bakteriler Gram pozitif veya negatif ise. Gram boyama, bakterileri en yaygın iki tip arasında bölen bir yöntemdir: Gram pozitif ve Gram negatif. İlki, Gram-negatif bakterilerin ince duvarları olarak en iyi boyamaya sahip olan peptidoglikan denilen bir polimerden oluşan kalın bir hücre duvarına sahiptir.
- Bazı yaygın Gram-pozitif bakteri tipleri streptokok, stafilokok, mikrokok (veya mikrokok) ve listeridir.
- Gram-negatif bakterilerin bazı yaygın örnekleri: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium ve Campylobacter.
- Uygun koruyucu önlemler alın. Test sırasında kullanacağınız bakteri ve kimyasal elementler sağlığınız için risk oluşturur. Boyama testini yaparken koruyucu gözlük, tek kullanımlık nitril eldiven ve laboratuar önlüğü giyin. İşiniz bittiğinde, eldivenleri ve diğer tüm bulaşmış malzemeleri özel bir torbaya koyun. Kirlenmiş ürünler için poşetten kurtulmak için laboratuvarınızın prosedürlerini takip etmeyi unutmayın.
- Bir cam slayt üzerinde gözlemlemek için örnek koyun. Teste başlamak için steril bir slayt üzerine bir damla veya bakteri örneği yerleştirin. Ardından bıçağı, numuneyi sabitlemek için üç kez yanan bir Bunsen yakıcısı üzerinde kaydırın ve reaktifleri durularken ya da eklediğinizde plakadan çıkmasını önleyin.
- Bıçağa 5 damla mor kristal ekleyin. Numune üzerine beş damla kristal mor solüsyon dökün. Numunenin kristal menekşeyi emmesi için bir dakika bekleyin.
- Bıçağı, kıyafet pimleriyle yerinde tutun, böylece ellerinizi lekelemeyin.
- Lekeyi çıkarmak için bıçağı iyice yıkayın. Bir musluk veya sıkma şişesi kullanın ve numuneye yapışmamış mürekkep artıklarını gidermek için suyun beş saniyeye kadar yavaşça akmasına izin verin.
- Slaydın üzerine beş damla Gram Diyot Leke dökün. Kristal viyole'nin bakterilerin hücre duvarları ile erimesine neden olan diyot, sodyum bikarbonat ve potasyum diodid'den oluşan bir çözeltidir. Numune üzerine çözeltiden beş damla dökün ve bir dakika bekletin.
- Örneği alkol veya laktik asitle yıkayın. Alkol ve lacetone ağartma maddesidir ve Gram negatif ise bakteri hücre duvarlarının boyanmasını önler. Numunenin üzerine birkaç damla çamaşır suyu dökün ve üç saniyeden daha uzun süre çalışmamasını sağlayın. Bundan sonra, bu ağartma maddelerini çıkarmak için beş saniye boyunca hafifçe suyla durulamayı deneyin.
- Ağartıcının uzun süre çalışmasına izin verirseniz, Gram pozitif bakterilerin lekelenmesine ve yanlış negatif sonuçlara neden olabilir.
- Safranin ile kontrast testi yapın. Safranin, kristal menekşe ile zıtlık yaratan kırmızı bir boyadır, dolayısıyla mor lekelenmeden etkilenmeyen bakterileri renklendirir. Numune üzerine yaklaşık beş damla safranin dökün ve bir dakika bekletin. Bundan sonra, beş saniye boyunca hafifçe suyla durulamayı deneyin.
- Numunenizi 1000X büyütmede görselleştirin. Gram pozitif ise bakteriler mor veya mor, safranin nedeniyle Gram negatif ise pembe olur.
Yöntem 2 Ziehl-Neelsen Boyama Testi gerçekleştirin
- Aside dirençli bakterileri tespit etmek için bu tekniği kullanın. Bu türler, Gram boyamada kullanılan boyalara karşı daha dirençli kılan daha fazla miktarda lipid içerir. Aside dayanıklı bakteriler, tüberkülozdan (M. tuberculosis) sorumlu bakteri içeren Mycobacterium cinsine aittir. Aside dayanıklı bir bakteri boyamak için, asitli veya sülfürik asit çözeltileriyle durulamaya dayanıklı, karbolik fuşsin adı verilen kırmızı bir boya kullanmanız gerekir.
- Uygun koruyucu önlemler alın. Ziehl-Neelsen boyaması sırasında kullanılan kimyasal ve biyolojik malzemeler tehlikeli olabilir. Ek olarak, Bunsen nozulu, elektrikli ısıtıcı veya alkol lambası gibi ısı kaynaklarını da kullanmanız gerekecektir. Testi gerçekleştirmek için aşağıdaki talimatları izleyin.
- Gözlük, nitril eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.
- Boyalar ve ağartıcılardan çıkan buharları solumamaya dikkat edin ve damlacıkların gözlerinize veya cildinize sıçramasına izin vermeyin. Kapları kaputun altında açık tutun.
- Bıçağı ısıtırken çok dikkatli olun. Kullanılan kimyasalların çoğu yanıcıdır. Slaytlarda ya da diğer ekipmanlarda yanıcı maddelerin izleri de olabilir.
- Bıçağı hazırla. Dairesel hareketlerle, steril bir lamın ortasına bakteri numunesinin küçük bir miktarını eşit şekilde dağıtın. Numuneniz yaklaşık 10 mm x 20 mm olmalıdır.
- Bıçağı kurutun. Bıçağı, numune yukarı bakacak şekilde kurutma yapısına yerleştirin. 30 saniye doğal olarak kurumaya bırakın. Bıçağı bir bezle kurutmaya çalışmayın.
- Numuneyi ısıyla sabitleyin. Örnek yukarıdayken, bıçağı iki veya üç kez yanan bir Bunsen ocağının üzerine kaydırın. En az iki saat boyunca sıcaklığı 65 ° C ile 75 ° C arasında ayarlayarak bıçağı bir elektrikli ısıtıcıya da yerleştirebilirsiniz. Numuneyi kaynatmama veya yakmamaya dikkat edin.
- Carbolic fuchsin'i bıçağa ekleyin. Slayt üzerine bu çözeltinin birkaç damla dökün. Numuneyi tamamen kaplayacak kadar dökün.
- Boyayı sabitlemek için bıçağı ısıtın. Slaydı dikkatlice Bunsen beki veya alkol lambasının üzerine, örnek yukarı bakacak şekilde ısıtın veya elektrikli ısıtıcı üzerine yerleştirin. Bıçağı 60 ° C'ye kadar veya buhar çıkarmaya başlayana kadar ısıtın. Boyanın beş dakika boyunca hareket etmesine izin verin.
- Elektrikli ısıtıcı kullanıyorsanız, 60 ° C'de açın. Alkol lambasını veya Bunsen brülörünü seçtiyseniz, duman görmeyi beklemelisiniz.
- Bıçağı beş dakika boyunca istenen sıcaklıkta tutmak için aralıklı olarak ısıtın.
- Numuneyi kaynatmama, yakma veya kurutmamaya dikkat edin.
- Bıçağı soğuk suyla çalkalayın. Beş dakika soğumaya bırakın ve temiz suyla birkaç saniye boyunca hafifçe durulayın. Örneğe yapışmayan boya lekelerini çıkarmak için musluk suyu veya sıkma şişesi kullanın.
- Numune asitli alkol veya sülfürik asidin üzerine dökün. Numuneyi tamamen kaplamak için hacimce% 3 hacim (hac / hac) alkol veya% 20 sülfürik asit kullanın. Renk soluncaya ve çok parlak bir pembe gölgeye ulaşana kadar asitin çalışmasına izin verin. İşlem genellikle yaklaşık on dakika sürer.
- Bıçağı durulamak için temiz su kullanın. Bıçağı bir musluğun altında ya da bir sıkma şişesi kullanarak yavaşça yıkayın. Tüm asit ve boya kalıntılarını iyice çıkarın.
- Kontrast maddesi ekleyin. Slaydı duruladıktan sonra, malakit yeşili veya metilen mavisi boyasını dökün. Bu iki çözelti, kırmızı boyanın ortaya çıkacağı mavimsi veya yeşilimsi bir arka planın yanı sıra, insan hücreleri ve aside dayanıklı olmayan bakteriler gibi diğer biyolojik materyalleri oluşturur. Maddelerin 1-2 dakika çalışmasına izin verin.
- Bıçağı durulayın ve kurulayın. Aşırı kontrastı gidermek için suyla iyice durulayın. İşiniz bittiğinde, bıçağın arkasını kuru bir bezle kurulayın ve bir stand üzerinde doğal olarak kurumasını bekleyin.
- Numunenizi 1000X büyütmede görselleştirin. Aside dayanıklı bakteriler kırmızı veya koyu pembeye döner. Diğer bakteriler, bakteriyel olmayan hücreler ve bıçağın tabanı yeşile veya maviye döner.
Yöntem 3 Bakterilerin davranış ve görünüşünü incelemek
- Bakterilerin şeklini analiz eder. Bakterilerin Gram pozitif, Gram negatif veya aside dirençli olup olmadığını belirlemek için boyama testi yapıldıktan sonra, türlerin daha kesin olarak tanımlanması zamanı gelmiştir. İlk olarak, slayttaki bakteri şeklini analiz edin. En yaygın üç biçim, kok (küresel), spiral ve basildir (çubuk şekli).
- Bu formların birkaç çeşidi vardır. Örneğin yuvarlak şekilli bakteriler (coccus) çiftler halinde (diplococci), zincirlerde, yığınlarda veya dörtlü gruplarda (tetrads) görülebilir.
- Bakterilerin aerobik mi yoksa anaerobik mi olduğunu bulun. İki bakteri örneği alın ve iki ayrı kültür oluşturun. Ayın anaerobik olması (oksijen olmadan yetiştirilmesi), diğerinin aerobik olması (oksijen ile yetiştirilmesi) gerekir. Anaerobik kültürü, büyümeyi gözlemlemeden önce en az 48 saat boyunca oksijensiz bir yerde 35 ° C'de saklayın.
- Bakteriler oksijensiz bir ortamda büyür, ancak oksijene maruz kalmazlarsa, bu anaerobik oldukları anlamına gelir.
- Oksijenli bir ortamda gelişmesine rağmen, oksijenin yokluğunda değil, aerobiktirler.
- Her iki ortamda da geliştiklerinde, fakültatif anaerobik bakterilerden söz ediyoruz.
- Bir hareketlilik testi yapın. Bir veya daha fazla flagella ile tek başına hareket edebiliyorsa, bir bakteri mobildir. Bazı bakteri türlerinin tanımlanmasında motilite derecesi çok önemlidir. Birkaç çeşit hareketlilik vardır, ancak en güvenli ve okunaklı yol yarı katı ortamdır.
- Hareketlilik testi için bir kültür oluşturun. Bir kültür suyu içinde bakteri kültürü hazırlayın. Seçtiğiniz suyu hazırlamak için aşağıdaki talimatları izleyin.
- Kültürü, hareketlilik testleri için yarı katı bir agara inoküle edin. Et suyu kültürünün bir kısmını steril bir aşılama iğnesiyle kaplayın. İğneyi, test için hazırladığınız TTC lagar gibi yarı katı dagar tüpüne dikkatlice yerleştirin. İğne, agarın 2 / 3'üne nüfuz etmelidir.
- İşiniz bitince, inokülasyon bölgesinin sınırlarını aşmamaya özen göstererek iğneyi dikkatlice çıkarın.
- Tüpü 30 ° C'de 48 saat inkübe edin.
- Test sonucunu okuyun. Hareketlilik testi için agar bakteri ile temasında kırmızıya dönecektir. Eğer hareketliyse, bu kırmızı veya pembemsi belirti madde boyunca yayılır. Aksi takdirde, boyama, enjeksiyon bölgesi ile sınırlı olacaktır.
Yöntem 4 Tüm sonuçları yorumla
- Yorumlarınızı toplayın. Bakterilerin çeşitlerini bilmek için kültürlerden, renklendirme testlerinden ve formların gözlemlerinden elde edilen bilgileri toplamanız gerekecektir. Bir hastanın numunelerini inceliyorsanız, sundukları semptomlar da uygun bakteri tipini belirlemeye yardımcı olabilir.
- Örneğin, testler bakterilerin gram negatif, anaerobik, hareketsiz olduğunu gösteriyorsa ve hastada karın ağrısı, bulantı ve kusma gibi semptomları fark ederseniz, hastanın Bacteroides enfeksiyonu geçirmesi olasıdır. fragilis.
- Bir veritabanına danışın. Dünyada binlerce bakteri türü vardır. Her şeyi yürekten bilmek mümkün değil. Test sonuçlarını bakteriyel türlerle ilgili bilgilerle karşılaştırmak için klinik bir mikrobiyoloji kitabına veya çevrimiçi veritabanına başvurmanız gerekecektir.
- Bakterileri tanımlamak için mükemmel çevrimiçi kaynaklar vardır, ancak bu veritabanlarının çoğu Patricbrc.org ve GlobalRPh dahil İngilizce olarak mevcuttur. Bununla birlikte, INRA International Microbial Resource Center web sitesinde faydalı bilgiler bulabilirsiniz.
- Bakterilerin kesin türlerini bilmek için genetik test yapın. Bazı durumlarda, bakteri türlerini tanımlamanız gerekebilir. En hızlı ve en kolay yöntem DNA testi yapmaktır. DNA testleri ayrıca geleneksel boyama ve kültür formlarına dayanıklı bakterileri tanımlamak için de faydalıdır. Günümüzde mikroorganizmalar üzerindeki DNA testleri çok hızlıdır ve iki saatten daha kısa sürede hazır olabilir.
- Mikroorganizmaların genetik dizilimini gerçekleştiren bir laboratuara erişiminiz yoksa, uzman bir kuruma bakteriyel bir numune gönderin.